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====== Culture de spores ====== Certaines spores, notamment celles de bactéries ou de champignons, présentent des caractéristiques remarquables de résistance: elles peuvent survivre pendant de longues périodes, même dans des conditions défavorables, et permettre ainsi la dispersion de l'espèce, parfois à une grande distance de son point d'origine, ou longtemps après la disparition du parent.[(ref:wp_spore)] Chaque [[fr:interieure:generative:recolte_spores|empreinte]] peut contenir de 100 000 à 100 000 000 spores, et chaque paire de ces spores ont le potentiel de développer un individu unique. Procédure: - Préparez votre matériel; empreinte de spores, [[fr:gelose:preparation|boîtes de Petri]], torche & boucle d'inoculation. - Un outil adapté (scalpel ou boucle d'inoculation) est stérilisé à la flamme. - D'une main, le couvercle d'une boîte de Petri est entrouvert. - La boucle est plantée au centre de la gélose, qui la refroidit au contact. Le résidu d'agar qui s'est collé à la boucle permettra une meilleure adhésion des spores. - Le ventilateur de la hotte est arrêté un instant, et l'empreinte de spore est délicatement ouverte. - La boucle est d'abord frottée sur l'empreinte, puis à la surface de la gélose, en y dessinant une forme en S. - Aussitôt la boîte de Petri refermée, et l'empreinte rangée, le moteur de la hotte est démarré à nouveau. - Pour augmenter vos chances de succès, inoculez une seconde boîte de la même manière. Il est préférable d'éviter une densité trop forte de spores afin de faciliter les étapes suivantes. Des milliers de spores ont été placés sur un substrat riche et stérile. Après leur germination, les hyphes des spores compatibles fusionneront pour former des cellules dicaryotes, contenant chacune deux noyaux. C'est à ce moment qu'apparaît le mycélium. Après 5 à 15 jours[(:ref:stamets_ggm)], de nombreux îlots de mycélium apparaîtront à la surface de la gélose. Dès qu'elles sont visibles, les colonies sélectionnées doivent être isolées dans de nouvelles boîtes. Chacune de ces colonies représente un cultivar possédant une génétique unique. {{:fr:gelose:spores_0.jpg?100|}}{{:fr:gelose:spores_1.jpg?100|}}{{:fr:gelose:spores_2.jpg?100|}}{{:fr:gelose:spores_3.jpg?100|}} Surveillez étroitement le développement de ces cultivars. Si vous apercevez le moindre signe de contaminant, empressez-vous de transférer le mycélium sain dans une nouvelle boîte. Au moment d'ouvrir la boîte contaminée, arrêtez temporairement le ventilateur, car le flux d'air risquerait de répandre davantage de spores indésirables. Prélevez un morceau de mycélium aussi loin que possible de la zone infecté. La nouvelle boîte devra être surveillée de près; aussitôt que le mycélium s'y développera, par précaution repiquez-le à nouveau. Même en l'absence de compétiteur, il est fréquent que deux mycéliums, issus de deux cultivars distincts se soient entremêlés. Cela se manifeste par une croissance sectorielle, vous pouvez alors tenter de diviser ses deux cultivars en repiquant un morceau de chacun à des points diamétralement opposés. {{:fr:gelose:spores_4.jpg?100|}} Lorsque vous obtiendrez des cultivars sains et non sectoriels, vous pouvez les entreposer dans des éprouvettes pour un usage ultérieur. Ces éprouvettes vous serviront de cultures mères et sont conservées précieusement. Avant d'en faire une culture à grande échelle, il est judicieux de [[fr:interieure:generative:floraison|tester chacun des cultivars]] pour évaluer leurs phénotypes respectifs. S'il vous est impossible de débuter avec une empreinte de spore "propre", vous pouvez réaliser les premières étapes sur un substrat enrichi d'antibiotiques, qui inhibera la croissance des bactéries. Dans les étapes subséquentes, le peroxyde d'hydrogène peut aussi vous faciliter la tâche, car il détruit la plupart des spores de champignons et de bactéries, sans toutefois nuire à la croissance du mycélium. ====== Stockage en éprouvette ====== Plusieurs raisons justifient l'emploi de cultures mères. Malgré tous les efforts déployés pour stériliser le substrat, il est fort probable qu'il y subsiste des organismes extrémophiles. Plus les générations avancent, plus ils sont susceptibles de se manifester. Compte tenu du volume restreint des éprouvettes, de la phase liquide de l'agar, et qu'elles sont le plus souvent préservées au froid, les contaminants y sont généralement inhibés ou inexistants. En second lieu, tout organisme vivant est limité par son vieillissement cellulaire. Plus les divisions sont nombreuses, plus leur vigueur est réduite. Les éprouvettes agissent comme une banque de cellules jeunes, capables de se multiplier vivement, souvent sur quatre ou cinq générations [de clones]. Elles peuvent se conserver plusieurs années si elles réfrigérées adéquatement. Procédure: - Sélectionnez votre plus beau spécimen [cultivé en boîte de Petri]. - [[fr:gelose:preparation|Préparez]] la gélose et les éprouvettes. - Lorsqu'elles sont refroidies, ouvrez l'éprouvette et tenez le bouchon entre deux doigts. Avec la même main, entre-ouvrez la boîte. - De l'autre main, à l'aide d'un scalpel stérilisé transférez un fragment de mycélium, de la boîte vers le tube. - Replacez le bouchon, et scellez-le à l'aide d'un film cireux tel que le Parafilm™. - Identifiez la culture; inscrivez-y la date, l'espèce, la variété, et l'âge (P). - Incubez les éprouvettes au chaud durant une à quatre semaines, jusqu'à ce que le mycélium recouvre toute la surface. - Sans attendre, placez-les ensuite au réfrigérateur, idéalement à 2°C. Évitez les fluctuations de plus d'un degré, et particulièrement le gel/dégel, qui risque de tuer le mycélium. Il est prudent de conserver entre deux et quatre copies de chaque variété. En présence d'humidité, certaines espèces ont tendance à produire du mycélium aérien. Pour éviter cela, vous pouvez placer quelques gouttes d'huile minérale à la surface (au préalable, stérilisez l'huile dans une seringue). Notez également que certaines espèces tropicales tolèrent mal la réfrigération, mais que la plupart s'y prêtent bien. Afin de préserver leur vigueur et de vérifier l'état de santé des cultures, une fois par année il est conseillé de cultiver une des copies dans une boîte de Petri. Si son développement est adéquat, vous pouvez la repiquer dans une nouvelle éprouvette, et l'étiqueter en conséquence. À des fins de suivit, il est vivement conseillé de noter l'âge cellulaire de vos cultures; lorsque vous obtenez un spécimen pur issu de spores, identifiez-le avec la mention "P1". Chaque fois qu'il sera cultivé à nouveau en boîte de Petri, sa mesure "P" augmentera d'un cran. Après environ dix transferts (P10), attendez-vous à constater des mutations ou une vigueur amoindrie.