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~~META:title=Préparation de la gélose~~ ====== Présentation ====== La gélose est un mélange de nutriments et d'agar-agar, un gélifiant végétal d'apparence semblable à la gélatine. La culture sur gélose permet de purifier une espèce jusqu'à la rendre axène. C'est un support qui rend facile le dépistage précoce des contaminants, et permet d'évaluer la santé d'une variété avant qu'elle soit propagée davantage. C'est une étape primordiale pour s'assurer de la pureté des toutes les cultures qui en découleront. On l'utilise aussi pour [[fr:Gelose:Culture de spores|isoler de nouveaux cultivars à partir de spores]]. ====== Préparation ====== L'agar-agar sert de support au mycélium, les autres ingrédients sont des nutriments. L'ajout de substrat final sert à familiariser le mycélium avec cette nourriture. Le moment venu, ce premier contact lui permettra de préparer plus rapidement les enzymes digestives nécessaires. Il existe plusieurs recettes pour préparer la gélose, en voici une simple et efficace:[(:ref:stamets_ggm)] [Pour <del><wrap em>37.5</wrap></del> ml, 1 boîte de Petri]; <WRAP box 300px right download>Pour formuler efficacement vos préparations, consultez le [[:fr:annexes:calculateur_recettes|calculateur de recettes]].</WRAP> * 37 ml eau * 0.7g agar-agar * 0.7g sucre de malt (extrait de malt) * 0.15g de substrat final (sciure de bois, paille en poudre...) * 0.1g levure * 0.06g farine (seigle/blé) * (facultatif) 0.04g peptone Un agitateur magnétique ou un mélangeur de cuisine est d'une aide précieuse pour préparer la gélose. Pour une éprouvette de culture mère 200 x 25 mm, adaptez cette recette pour 40ml d'eau/unité, et 11ml/u pour une éprouvette de 125 x 20 mm. ====== Préparation à la stérilisation ====== Au cours du processus de stérilisation, la gélose bouille vivement et prend beaucoup d'expansion. Il est essentiel de placer les couvercles sur les récipients, mais ils doivent être **lâchement serrés**. La gélose bouille fortement et on doit prévoir suffisamment d'espace pour éviter les débordements. Pour un erlenmeyer de 1000 ml, utilisez au maximum un volume total de <del><wrap em>450</wrap></del> ml (recette pour 12 boîtes/450 ml d'eau). Il est aussi impératif de **laisser la pression retomber complètement** avant d'ouvrir la valve de l'autoclave. Un changement brusque de pression provoque l’ébullition de la gélose et ferait déborder le récipient. ===== Boîtes de Petri ===== La gélose et les boîtes doivent être stérilisées séparément. Idéalement, la gélose est placée dans un erlenmeyer de plastique autoclavable ([[wpfr>polyméthylpentène]]). On peut substituer l'erlenmeyer par un pot mason, mais la chaleur conduite par le verre rend le récipient difficile à manipuler. L'embout étroit d'un erlenmeyer rend aussi le transvasement plus aisé, et permet de limiter la possibilité qu'une contamination aérienne ne tombe dans la gélose. Les boîtes de Petri peuvent être emballées dans du papier d'aluminium, ou dans une serviette (plus facilement réutilisable). {{:fr:gelose:1.jpg?100|}} {{:fr:gelose:2.jpg?100|}} {{:fr:gelose:3.jpg?100|}} {{:fr:gelose:4.jpg?100|}} {{:fr:gelose:5.jpg?100|}} {{:fr:gelose:6.jpg?100|}} ===== Éprouvettes ===== Comme les éprouvettes sont profondes, on peut y placer directement la gélose avant la stérilisation. Elles sont ensuite placées dans un support adéquat. {{:fr:gelose:1_2_.jpg?200|}} ====== Stérilisation ====== L'erlenmeyer de gélose, les boîtes et/ou les éprouvettes sont donc finalement placés dans l'autoclave, puis recouverts d'une serviette. L'ensemble est stérilisé à 15 psi durant 45 minutes. Une fois la pression retombée, l'autoclave est ouvert, et le contenant interne est apporté devant la hotte à flux laminaire. La serviette peut être retirée à ce moment. Les supports à éprouvettes sont surélevés d'un côté afin que la gélose fige dans un angle de 20º. Pour les boîtes, on procède immédiatement au [[fr:gelose:transvasement]]. ====== Recyclage de la gélose ====== L'agar-agar de qualité est dispendieux. Il semble servir uniquement de support, car le mycélium ne s'y développe qu'en surface, à partir des nutriments ajoutés. Pour la recycler, il suffit de placer le contenu des boîtes de Petri usagées sur du papier-parchemin, puis au déshydrateur. On peut alors conserver la gélose sèche à température pièce, dans une pot hermétique. Elle sera ensuite réduite en poudre et réutilisée. Il faudra éventuellement la supplémenter de nutriments, mais [[fr:annexes:experiences:determiner_la_quantite_de_sucres_residuels_dans_la_gelose_usagee|les quantités sont à déterminées.]] {{:fr:gelose:dscf2013.jpg?100|}} La déshydratation est le moyen privilégié, car la congélation semble causer l'éclatement des cellules, réduisant ainsi la fermeté de la gélose. Cet inconvénient pourrait probablement être corrigé en ajoutant un peu d'agar-agar neuf. Il n'est pas nécessaire de retirer le mycélium, mais ne **recyclez que la gélose saine, non contaminée!** ====== Nettoyage des éprouvettes ====== Dans une casserole d'eau, placez les éprouvettes dans un support, sans couvercles, goulots vers le haut et couvercles lâchement serrés. Réchauffez l'eau jusqu'à liquéfaction de la gélose, puis procédé tel qu'indiqué ci-haut. Alternativement, vous pouvez les réchauffer dans un autoclave.